promega(promega)

实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。

主要实验步骤如下：

1. 设计并合成Realtime PCR引物。

2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR? Green）的PCR反应的优化。

3. 样品RNA抽提

a．实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。

b．实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。

4. RNA质量检测

a．紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度。

b．使用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

5. 使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。

6. 制备标准曲线样品：进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线

7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中（其中TaqBeadTM热启动聚合酶来自Promega公司），进行RealTime PCR扩增和检测

8. 检测结果进行标准曲线分析，以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的

目的基因相对含量。

应用原理

转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

其原理简述如下：

（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。

（2） 将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。

（3） 加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。

技术流程

（1） 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

（2）设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段，将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒（pGL3-basic）中。

（3）筛选阳性克隆，测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

（4） 扩增转录因子质粒，提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照，提纯备用。

（5） 培养293（或其它目的细胞），并接种于24孔板中，生长10-24小时（80%汇合度）。

（6） 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

（7）提取蛋白并用于荧光素酶检测。

（8） 加入底物，测定荧光素酶的活性。

（9） 计算相对荧光强度，并与空载对照比较。

发展

双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时, 通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal, GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供 PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们体会到该系统的便利。

体外分泌的荧光素基因:目前NEB公司提供新型的可在细胞外分泌的荧光素酶,分别是Gluc和Cluc,具体使用帮助可在NEB官方网站找到.