砜的结构式
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R - S - R
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亚砜的结构式
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R - S - R
向活化反应产物中加入二氨基原酸酯单体和无水n,n-二甲基甲酰胺进行聚合反应，得到聚合物前药；
所述二氨基原酸酯单体和无水n,n-二甲基甲酰胺的投料比例为1：2-5；
所述四价铂配合物单体与二氨基原酸酯单体的投料摩尔比例为1：1。
进一步的，所述四价铂配合物单体为两端羧基顺铂，化学式为pt(nh3)2cl2(oocch2ch2co2h)2，具有式(ii)所示结构：
所述二氨基原酸酯单体为4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)。
进一步的，所述羧基活化剂选自n-羟基琥珀酰亚胺、edc、nhs中的一种。
进一步的，所述步骤(1)的反应过程为在室温、干燥、避光、搅拌条件下反应4-6h。
进一步的，所述步骤(2)的反应过程为在氮气环境下避光、搅拌反应2-4天。
本发明还提供一种四价铂配合物-原酸酯聚合物前药胶束，由如上所述的四价铂配合物-原酸酯聚合物前药或由如上所述的制备方法制备的四价铂配合物-原酸酯聚合物前药制备得到。
本发明还提供一种如上所述的四价铂配合物-原酸酯聚合物前药胶束的制备方法，其特征在于：用二甲基亚砜充分溶解聚合物前药，之后进行透析处理，得到四价铂配合物-原酸酯聚合物前药胶束。
本发明还提供一种如上所述的四价铂配合物-原酸酯聚合物前药作为药物载体在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步的，所述应用通过如下步骤实现：四价铂配合物-原酸酯聚合物前药与药物载体按8-12：1的质量比混合后置于二甲亚砜中，待充分溶解后置于透析袋中透析,得到四价铂配合物-原酸酯聚合物载药胶束；
所述药物载体为喜树碱、紫杉醇、阿霉素、5-氟尿嘧啶中的一种。
本发明的有益效果在于：事实上，肿瘤细胞的环境较正常细胞而言，具有还原性谷胱甘肽的浓度较高，ph较低等特点。有基于此，本发明提供一种四价铂配合物-原酸酯聚合物前药，其包含有较高浓度的四价铂，可长时间稳定存在于血液中。同时在可还原的四价铂的基础上引入高敏感性的原酸酯键酸，其能在肿瘤细胞特殊的还原性和ph环境下做出响应，发生断裂，引起抗肿瘤药物的释放。因此，本发明提供的前药具有在肿瘤细胞内与ph和还原条件双重响应的特性，药物选择性得到提高，具有靶向、协同增敏等作用，能降低药物的毒副作用和耐药性。
此外，四价铂配合物为八面体构型，较二价铂抗癌药而言，反应活性较低，并具有取代动力学惰性，不易与细胞内的谷胱甘肽，蛋白等生物分子发生取代反应，使其能够完整的到达癌细胞。由于四价铂配合物具有较高的亲脂性，因此其容易被癌细胞吸收。
附图说明
图1是本发明实施例1中聚合物前药的核磁共振氢谱图；
图2是本发明实施例2中前药胶束ocm的粒径分布图；
图3是本发明实施例2中前药胶束ocm的透射电镜图；
图4是本发明实施例3中前药胶束ocm的临界胶束曲线；
图5是本发明实施例5中前药胶束ocm的pt及其载药胶束ocm/d的dox在不同ph条件下的释放曲线；
图6是本发明实施例6中在dtt存在下载药胶束ocm/d的pt和dox不同ph条件下的释放曲线；
图7是本发明实施例7中前药胶束ocm对hepg2细胞的毒性试验结果图；
图8是本发明实施例7中载药胶束ocm/d对hepg2细胞的毒性试验结果图；
图9是本发明实施例8中前药胶束ocm对h22细胞的毒性试验结果图；
图10是本发明实施例8中载药胶束ocm/d对h22细胞的毒性试验结果图；
图11是本发明实施例9中载药胶束ocm/d对hepg2和h22细胞摄取情况的定性检测结果图；
图12是本发明实施例9中载药胶束ocm/d对hepg2和h22细胞摄取情况的定量检测结果图。
具体实施方式
实施例1：四价铂配合物-原酸酯聚合物前药的制备
(1)向25ml干燥反应瓶中加入0.350g(0.65mmol)分子量为534.05的两端羧基顺铂、0.314g(1.64mmol)分子量为191.7的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、0.189g(1.64mmol)分子量为115.09的n-羟基琥珀酰亚胺，之后加入3ml无水n,n-二甲基甲酰胺和0.2ml无水三乙胺，室温避光搅拌反应5h；
(2)加入0.202g(1.64mmol)预先用0.5ml无水n,n-二甲基甲酰胺溶解的分子量为308.328的4,4’-二亚甲氧基-二-(2-氨基乙氧基-1,3-二氧戊烷)，在氮气保护下避光搅拌3天，之后将反应产物转移到截留分子量为1000d的透析袋中用水透析12h，冷冻干燥，得到0.468g四价铂配合物-原酸酯聚合物前药p(oeds-cp)，产率84.78％。1hnmr(400mhz，dmso-d6，δ，ppm)：2.82-2.89(t,4h,h2-nh2),3.51-3.74(m,8h,nh-ch2-ch2,ch2-o-ch2),3.77-4.19(m,4h,ch-o-ch2),4.29-4.50(m,2h,ch2-ch-ch2),5.85-5.87(d,2h,ch-(o)3)，6.48(s,6h,-nh3),2.15-2.43(m,-ch2-ch2)，见图1。所有核磁峰的位置以及面积积分比均正确，表明该聚合物被正确合成。
实施例2：前药胶束的制备
取20mg实施例1制备的前药，用2ml二甲基亚砜溶解后转移到截留分子量为500d的透析袋用水中透析2h，得到前药胶束ocm。
通过光子相关光谱(dls)检测本实施例2制备的胶束的粒径分布，结果如图2所示。从图2可以看出，所制备的胶束粒子，其粒径在100-200nm左右。
通过透射电镜检测本实施例2制备的胶束的形貌，结果如图3所示。从图3可以看出，所制备的胶束粒子，其形态呈大小均一且规则的球形。
实施例3：前药胶束临界胶束浓度的测定
利用尼罗红检测法测定实施例2制备的前药胶束ocm的临界胶束浓度，其临界胶束曲线如图4所示。从图4可以看出，实施例2制备的胶束ocm，其临界胶束浓度为1.12×10-5mg/ml。
采用尼罗红检测法的具体检测过程如下：
(1)向8只棕色瓶中分别加入20μl浓度为1.0×10-4mol/l尼罗红的丙酮溶液；
(2)将实施例2中制备的聚合物前药胶束ocm冷冻干燥后，用ph＝7.4的磷酸缓冲溶液分别配制成浓度为1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1mg/ml的梯度ocm溶液；
(3)待棕色瓶中的丙酮完全挥发后，分别取2ml各梯度溶液加入到各棕色瓶中，室温条件下避光孵育12h；
(4)使用荧光分光光度计测定各溶液中尼罗红的发射光谱；
(5)在各浓度下的发射光谱图上找出最大荧光强度所对应的波长，作浓度-波长曲线图，则该曲线突变点对应的浓度即为ocm的临界胶束浓度值。
实施例4：载药胶束的制备
取80mg实施例1制备的前药和8mg阿霉素，用5ml二甲基亚砜溶解后转移到截留分子量为500d的透析袋用水中透析2h，得到载药胶束ocm/d。
实施例5：前药胶束ocm的pt及其载药胶束ocm/d的dox在不同ph条件下的释放检测
分别取1mlpt浓度为500μg/ml的前药胶束ocm和1ml阿霉素浓度为500μg/ml的载药胶束ocm/d，转移至截留分子量为8kd-14kd的两个透析袋用水中，放入到含有5ml的ph分别为5、6.5、7.4的缓冲液的ep管中，设3个重复，在37℃，100rpm条件下振荡，分别在30min、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36、48、72小时后取出缓冲液，并加入新的缓冲液。然后通过icp-ms检测铂的释放量和通过酶标仪检测缓冲液中的阿霉素浓度，计算阿霉素的释放量，释放结果如图5。由图5可知：ocm与ocm/d在中性环境下相对稳定，基本没有药物释放；ph越小，药物释放越多。由此说明前药胶束与载药胶束均具有酸敏感性。
实施例6：在dtt存在下载药胶束ocm/d的pt和dox不同ph条件下的释放
取1ml阿霉素浓度为500μg/ml的载药胶束ocm/d于截留分子量为8kd-14kd的透析袋中，放入到含有5ml的ph＝5、6.5、7.4的20mmddt缓冲液的ep管中，设3个重复，在37℃，100rpm条件下振荡，分别在30min、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24小时后取出缓冲液，并加入新的缓冲液。通过icp-ms检测铂的释放量和通过酶标仪检测缓冲液中的阿霉素浓度，然后计算阿霉素的释放量，释放结果如图6。由图6可知：ocm与ocm/d在ddt存在条件下药物释放速度比无ddt存在时释放较快，说明胶束具有还原敏感性。
实施例7：前药胶束ocm和载药胶束ocm/d对hepg2细胞的毒性检测
(1)向96孔板中加入人肝癌细胞(hepg2)，保证每孔的细胞浓度在4,000个左右，贴壁培养24h后，去除培养基，加入180μl的新鲜培养基；
(2)取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl的顺铂水溶液(cp)，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组1；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl前药胶束ocm，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组2；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl顺铂与阿霉素混合水溶液(cp+dox)，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组3；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl载药胶束ocm/d，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组4；
(3)实验组1-4分别共培养24h和48h后，去除培养基；然后加入180μl的新鲜培养基和20μlmtt(5mg/ml)共培养4h后，去除培养基；之后加入150μl的dmso，震荡10min后，在570nm波长下检测，结果如图7和8，其中，图7为cp与ocm组细胞毒性结果，图8为cp+dox和ocm/d组细胞毒性结果。
由图7和8可知：ocm与ocm/d表现出剂量和时间依赖性毒性，且ocm组毒性大于cp组，ocm/d组毒性大于cp+dox组，ocm/d细胞毒性最强。
实施例8：前药胶束ocm和载药胶束ocm/d对h22细胞的毒性检测
(1)向96孔板中加入小鼠肝癌细胞(h22)，保证每孔的细胞浓度在4,000个左右，补充新鲜培养基至180μl；
(2)取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl的顺铂水溶液(cp)，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组1；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl前药胶束ocm，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组2；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl顺铂与阿霉素混合水溶液(cp+dox)，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组3；
取一步骤(1)中的96孔板，向每孔中分别加入20μl载药胶束ocm/d，使每孔中的顺铂终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16μg/ml，得实验组4；
(3)实验组1-4分别共培养24h和48h后，加入20μlmtt(5mg/ml)共培养4h；然后加入150μl的三联甲瓒溶液，震荡10min后，在490nm波长下检测，结果如图9和10,其中，图9为cp与ocm组细胞毒性结果，图10为cp+dox和ocm/d组细胞毒性结果。
由图9和10可知：ocm与ocm/d对h22细胞的毒性测试结果与对hepg2细胞的毒性结果相似。
实施例9:载药胶束ocm/d对hepg2和h22细胞摄取情况的定性检测
a组实验：
(1)向底部带有盖玻片的12孔板中加入人肝癌细胞(hepg2)，保证每孔细胞浓度在105个左右，培养过夜后，去除培养基，加入1.8ml新鲜培养基；
(2)取一步骤(1)中的12孔板，向每孔中加入0阿霉素终浓度为8μg/ml的自由阿霉素，得实验组1；
取一步骤(1)中的12孔板，向每孔中加入0.2ml阿霉素终浓度为8μg/ml的聚合物载药胶束ocm/d，得实验组2；
(3)实验组1-2分别共培养0.5h和4h后，去除培养基，先用pbs冲洗2次，再用4％多聚甲醛液固定细胞，5min后用pbs冲洗2次，然后用染核试剂染细胞核，10min后用pbs洗2次，离心收集细胞，之后用0.5mlpbs分散，使用激光共聚焦显微镜观察。
b组实验：采用a组实验的方法，不同之处在于，所述步骤(1)中加入的细胞为小鼠肝癌细胞(h22)。
a组和b组实验的结果如图11所示。由图11可知：ocm/d组与freedox组有不同程度的红色荧光信号，说明载药胶束能够成功的被细胞摄取。在0.5h时无明显差异，孵育时间增加到4h后，ocm/d组荧光强度明显高于freedox组。
实施例10：载药胶束ocm/d对hepg2和h22细胞摄取情况的定量检测
a组实验：
(1)向6孔板中加入人肝癌细胞(hepg2)，保证每孔细胞浓度为2.5×105个细胞左右，培养过夜后，去除培养基，加入1.8ml新鲜培养基；
(2)取一步骤(1)中的6孔板，向每孔中加入自由阿霉素，至阿霉素终浓度为8μg/ml；
取一步骤(1)中的6孔板，向每孔中加入载药胶束ocm/d，至阿霉素终浓度为8μg/ml；
(3)实验组1-2分别共培养0.5h和4h后，去除培养基，先用pbs洗2次，再用胰酶消化，之后离心收集细胞，并用0.5ml的pbs分散后用流式细胞仪检测。
b组实验：采用a组实验的方法，不同之处在于，所述步骤(1)中加入的细胞为小鼠肝癌细胞(h22)。
a组和b组实验的结果如图12所示。由图12可知：ocm/d组与freedox组摄取量比较结果与定性实验中荧光强度比较结果一致，即0.5h时差异不明显，4h时ocm/d摄取量大于freedox组。
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