聚丙烯酰胺凝胶配制(聚丙烯酰氨凝胶电泳的实验材料)

一．设备

进行凝胶电泳的装置见图版4。

1）直流电源如果一次进行电泳的管数在20管以内可以用最大电流300毫安的整流器（硅或硒整流器），调压范围0—300伏。

2）电泳装置包括二个缓冲液槽和电泳 管。液槽可以用玻璃或塑料制成，在底部钻孔。插入电泳管，用有孔橡皮塞固定。电泳管选用孔径均匀一致的玻璃管切制。长10厘米，内径 ^5毫米。脱色用玻璃管长10厘米，内径8毫米。底部稍拉尖，用半透膜及橡皮圈套住底部。

3）凝胶管架灌装凝胶管时使管保持垂直位置，用有机玻璃制成。

二．操作方法

1）凝胶管的制备将电泳玻管用小橡皮塞塞住底部，然后灌入新配的凝胶溶液（方法见下文）。每管加至液体高度为7．5厘米。为了保证凝胶表面平整可用注射器通过细针头小心地加一层（高约1厘米）蒸馏水于表面上，勿使与凝胶液混合，室温放置。如果条件合适溶液于 30—60分钟内聚合而成凝胶。凝胶溶液的配制方法如下：溶液甲：丙烯酰胺（氯仿重结晶）25克，双体（甲醇重结晶）1克，加水配成100毫升溶液。必要时用三羟甲基氨基甲烷调pH至7．0。溶液乙：二甲氨基丙腈l毫升，三羟甲基氨基甲烷0．85克（也可用0．625克氨三乙醇或氨乙醇）加水至100毫升。溶液丙：K3Fe(cN)6分析纯0．075克，加水至100毫升新配。用作阻聚剂以延缓凝聚时间。使操作方便，如凝聚时间已足够长可以用蒸馏水代替。溶液丁：过硫酸铵（二级）2．8克加水至 100毫升新配。必要时用氨水调pH至7．0 c， 溶液甲及乙配后可在冰箱中保存数月。溶液丙及丁用时新配。临用前将溶液甲、乙、丙、丁等量混合。

2）准备把已灌装凝胶的玻管通过有孔椽皮塞安装在上面液槽的底孔中，在上下两槽内分别注入缓冲液。装上后电泳管下端应浸没在下槽的缓冲液中，管下端勿留气泡。血清电泳可以用巴比妥缓冲液pH一8．6，离子强度0．05（配法：巴比妥钠10．3克，二乙基巴比土酸1．84克，加水至1升，温热使溶。加硫柳汞0．1克防霉）。

3）加样在资料介绍的方法中，一般还在了这一步。在血清样品中加入少量蔗糖以增加密度，用血红蛋白吸管直接小心地加在凝胶表面上，加样量一般为7微升血清。如果在样品中混入少量溴酚兰指示剂就可以在电泳过程中观察前沿移动的情况。

4）电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。侍染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1一2小时。电泳完毕取下凝胶管，用细长针头沿管壁注蒸馏水，使凝胶与管壁剥开。然后用橡皮球压出凝胶条。

5）染色及脱色电泳后的凝胶条在1%氨基黑10B在7%醋酸溶液中固定并染色1小时以上。染色后的凝胶条用7%醋酸洗涤数次。置于脱色玻管中，在同一电泳装置中电解脱色。此时改用7%醋酸充装在液槽中。通电后过剩凝胶之上再加一层大孔凝胶，样品聚合在最后的另一层凝胶中（图2）。在我们的试验中省略的染料泳向正极。脱色时电场强度25伏/厘米，电流10—1 5毫安/管。3—4小时脱色完毕。增高电压可以加速脱色。有色的醋酸溶液通过盛有活性炭的漏斗过滤，即可除去染料，重新使用。

6）保存与记录脱色后的凝胶可以装在盛有7%醋酸的有塞试管中保存数年。也可以自然干燥后保存，在需要观察时再浸在7%醋酸中溶胀成原来形状。记录可以用照相摄影。也可以用光密度计进行捕记。光密度计的分辨力决定于其狭缝宽窄及光电管放大倍数。

三、实验结果

1．电泳条件的选择

为了选择血清蛋白电泳较合适的条件，我们分别对单体浓度、双体浓度、配制凝胶时所用不同正离子、各种电压、二甲氨基丙腈的浓度、过硫酸铵的浓度等条件进行了试验。根据以上试验结果，我们在分离血清蛋白时选用的条件是：单体浓度6.25-6.5%，双体占总丙烯酰胺量的4—5%，正离子采用三羟甲基氨基甲烷，二甲氨基丙腈及过硫酸铵浓度分别为0.25%及0.7%。电泳电压以7—10伏/厘米较为合适。但电泳时间较长，约2—3小时，室温低时可以电压稍高。如果室温较高则可以在冰箱中进行电泳。

2．人血清及其酒精分划部分的凝胶电泳

采用上述条件我们进行了正常人血清的凝胶电泳。一般可以分成15—20条区带。我们也根据RaFmand介绍的两向电泳方法比较了纸电泳和凝胶电泳各区带的相对关系。纸电泳上的a：区带在凝胶电泳中可被分离成10条以上区带。但纸电泳中d，区带的一部分则与凝胶电泳中自蛋白区带相重合。二种电泳方法所得的图谱见图版9。在正常人血清中后白蛋白（PA）、转铁蛋白(Tr）和触珠蛋白（HP）均有不同的型， 一例骨髓瘤病人血清的和凝胶电泳自由电泳图谱的比较见图版11、12。我们也比较了酒精分划人血浆各部分的纸电泳和凝胶电泳图谱，结果见图版13。从图中可见在纸上电泳检定时看来较纯晦白蛋白和丙种球蛋白部分，在凝胶电泳中可见明显的其他蛋白区带。

3．放射病狗血清蛋白电泳的观察 放射病动物血清蛋白的改变可以在纸电泳中观察到。一般认为狗在照射后吻球蛋白有增高。用凝胶电泳观察可以得到更深入的资 料。正常狗血清的凝胶电泳图谱大致与人相 似。狗受致死量照射后第九天有明 显变化，至极期时则可以观察到鸭、Tr、融及 sp等区带有明显增高。我们用胎3—10型光 谱仪用光密度计将电泳图谱进行了扫描，所得 结果见图3，图版14。由于仪器的限制光缝 最小只能达到0．5毫米，从而影响了其分辨力。但与正常血清对比可以见到其改变的情况，这 远比纸电泳中所见更为明显。我们认为如果联 系临床表现对变化的本质进行一些研究，将有 助于了解放射病极期来到前后体内蛋白质代谢的一些情况。

4．在分离正常人尿DNase时的凝胶电泳 观察 用葡聚糖凝胶分离人尿中DNase时可以除去大部分其他蛋白质和杂质。但分离所得的制品用凝胶电泳观察还可以见到五条以上的蛋白质区带（见图版14）。将凝胶条在未染色前置于含大分子DNA的琼脂平板上，在37c’温箱中保温2—3小时，再用5%三氯醋酸加至如此处理过的琼脂板上，可以看到乳白色本底上出现被酶水解后的透明斑点。将凝胶条用氨黑染色后显示其蛋白区带的位置。二者比较就可以确定具有酶活性的成分的相应电泳位置。我们的试验中观察到人尿DNase在凝胶电泳中至少被分离成二条以上有酶活性的区带。说明有同功酶的可能。应用这一方法可以较深人地观察体液中酶的情况。同时也说明可以用凝胶电泳来指示生物制剂制备过程中纯化的情况。

四、结 论

本文介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的一些初步实验条件和实验结果，并与纸电泳、自由电泳等进行了对比。从结果中可以看到聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨力较强，重演性良好。它在临床生化分析及生物活性物质的分离、制备中和纯度鉴定中具有较广泛应用的可能性。

sds-page凝胶电泳怎么制备

丙烯酰胺(acrylamide,ACR)。 30% acrylamide-bisacrylamide（丙烯酰胺：双丙烯酰胺=29:1）的水溶液是你说的那个东西，标准的叫法是30%Acr-Bis，但有时为了简便就直接叫30%ACR了，不过为了与丙烯酰胺区别开（毕竟还含有双丙烯酰胺嘛）就把y也加上了。

SDS-PAGE电泳可用于分离蛋白质和核苷酸 ，这里综述了SDS-PAGE实验原理、试剂和器材、以及实验操作步骤。

一. 实验原理：

SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子 量不同来进行分离的。

SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子 量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。

二. 试剂和器材：

试剂：1. 5x样品缓冲液(10ml)：0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8)，5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在-20℃保存数月。

2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。

3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。

4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。

5. TEMED(四乙基乙二胺)原液

6.10%过硫酸铵(用重蒸水新鲜配制)

7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。

8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。

器材：电泳仪 ，电泳槽，水浴锅，摇床。

三. 实验操作;

1. 样品制备

将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个eppendorf 管中混合。放入100℃加热5-10min，取上清点样。

2. 分离胶及浓缩胶的制备

① 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干;

② 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板;

③ 按如下体积配制10%分离胶8.0 ml，混匀：ddH2O 3.0 ml;1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml;30% Acr-Bis 2.8 ml;10% SDS 80 ul;10%AP 56 ul;TEMED 6 ul。

④ 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合;

⑤ 按如下体积配制6%浓缩胶3.0 ml，混匀：ddH2O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30% Acr-Bis;2.0 ml 400 ul 600 ul;10% SDS 10% AP TEMED;36ul 24ul 4ul。

⑥ 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳;

⑦ 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 ?l;

⑧ 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.

⑨ 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr;加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液(10 ml 冰乙酸;45 ml乙醇;45 ml蒸馏水)至完全脱净。

聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应，可根据蛋白亚基分子量不同将分离蛋白，SDS-PAGE电泳凝胶好坏直接关系到电泳能否成成，一般浓缩胶和分离胶的pH分别是6.7和8.9.